תפילת נעילה היא התפילה החמישית והאחרונה הנאמרת לקראת סיומו של יום הכיפורים. היא נאמרת בשעה שבה ננעלו שערי ההיכל בבית המקדש ביום הכיפורים, הנחשבת גם לשעה שבה "ננעלים שערי שמיים", הפתוחים לתפילות באופן במיוחד ביום זה.
בניגוד לימי החול שבהם מתפללים שלוש תפילות, או לשבתות וחגים שבהם מתפללים ארבע תפילות (כולל תפילת מוסף), יום הכיפורים הוא היום היחיד בשנה שבו מתווספת תפילה ייחודית זו, המהווה את נקודת השיא והחתימה של היום הקדוש כולו.
בשל חשיבותה המכרעת של שעת חתימת הדין, מתאפיינת תפילת נעילה במאמץ רוחני אחרון ובהתרגשות רבה. נוסח התפילה משתנה מבקשת "כתיבה" ללשון "חתימה": למשל, במקום לבקש "וכתוב לחיים טובים כל בני בריתך", אומרים "וחתום לחיים טובים כל בני בריתך". נוסף על כך, ארון הקודש נשאר פתוח לרווחה לאורך כל חזרת שליח הציבור בתפילת העמידה, והציבור נוהג לעמוד על רגליו במהלך כל התפילה.
התפילה מגיעה לשיאה ברגעיה האחרונים בקבלת עול מלכות שמיים משותפת באמירת "שמע ישראל" ו"ה' הוא האלוהים", ומייד לאחר מכן בתקיעת שופר המבשרת את סופם של הימים הנוראים ואת תחילתה של שנה חדשה ומבורכת.